【世界聚看點】蛋白水解靶向嵌合體PROTAC技術的研究進展

蛋白降解靶向嵌合體技術（PROTAC），是利用異雙功能小分子化合物將靶蛋白和細胞內E3連接酶拉近，利用生物體內泛素-蛋白酶體蛋白降解途徑特異性降解靶蛋白。PROTAC分子由3部分組成，一端是特異性E3連接酶配體，另一端是靶蛋白的特異性配體，以及中間的連接子，從而組成“靶蛋白-PROTAC-E3連接酶”三元復合物。

自20多年前報道了第一個PROTAC小分子，靶向蛋白降解技術已從學術研究走向工業界，許多生物技術和醫藥行業已經進行了相關臨床前和早期臨床項目研究。2019年，第一個PROTAC分子進入了臨床試驗；2020年，針對兩個已確定的癌癥靶點：雌激素受體(ER)和雄激素受體(AR)完成了臨床概念驗證。隨后，來自Bristol Myers Squibb (BMS)、Nurix Therapeutics、Kymera Therapeutics、Dialec Therapeutics、Foghorn Therapeutics等公司的降解劑也進入了臨床研究。

(資料圖)

PROTAC在分子水平上的開發過程如圖所示，包括選擇靶標，設計合成PROTAC分子，實驗驗證其降解能力、降解機制、三元復合物的形成、降解選擇性、以及最后的藥代及藥效等。

PROTAC靶向蛋白降解技術在臨床上完成了概念驗證后，各種衍生的蛋白降解技術紛紛出現，在生物醫藥領域新的應用場景不斷被發掘。首批完成概念臨床試驗的PROTAC藥物靶向成熟靶點，具備成為“best-in-class”藥物的潛力。接下來將介紹未來PROTAC的發展方向。

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優化PROTAC分子的理化性質

1997年引入的Role5有助于識別可能具有高口服生物利用度的候選藥物（MW≤500，logP≤5，H鍵供體≤5，H鍵受體≤10）。隨著PROTAC的研究進展，與良好的藥代動力學特征相關的理化性質將可以預測。例如：通過搜索Roche化合物庫，Cantrill等人發現PROTAC分子符合PSA、MW和AlogP的3D圖中的bRo5空間，并且三者都有隨時間減少的趨勢。此外，即使PROTACs具有多個電離中心，精確的pKa值也可以通過完整的PROTAC分子來測量。并且可以通過色譜法來測量分布系數logD。

滲透率最好通過細胞滲透率測定來確定，因此需要優化培養條件，但目前PAMPA可能不適用于降解劑的滲透性評價。在水介質中，可以利用熱力學溶解度實驗來測量滲透率。此外，在研究具有環基團的分子時，應充分考慮分子的柔韌性。酰胺-酯取代策略可用于改善類似protac模型化合物的理化性質。目前已經開發了多參數評分函數ABMPS等指標，為這類化合物的設計提供指南(AB-MPS評分越低，吸收的可能性越高)。

目前大多數研究都集中在CRBN靶向分子上，因為IMiDs的分子量較低，氫鍵供體和受體數量較少，脂溶性較高，符合口服化合物的原則。在AstraZeneca PROTAC分子文庫中發現，使用沙利度胺/泊馬度胺/來那度胺衍生的CRBN E3連接酶配體的多個PROTAC分子，口服生物利用度(>30%)相對較高。

目前研究人員獲得以下結論：1、基于CRBN配體的PROTAC比基于VHL配體的口服利用度更高。2、色譜LogD7.4值在4.5 ~ 6.5之間時可能會獲得理想的口服生物利用度。3、口服生物利用度高的PROTACs會違反Ro5的2 ~ 3項。

總體而言，與小分子藥物相比，PROTAC的理化性質預測仍處于分散探索階段，尚未形成明顯規律，但未來“PROTAC Role 5”一定會出現并完善。

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計算機輔助設計PROTAC分子

在PROTAC這個快速發展的領域，需要合成大量的類似物來探索結構變化，以鑒定有效的降解劑。在沒有大量試驗和錯誤的情況下合理有效地設計PROTACs仍然是一個挑戰。目前利用計算機輔助高效設計protac和預測形成的三元配合物的結構已成為趨勢。此外，對接模擬和分子動力學已被用于發現最 佳連接體長度和理想位置。

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擴大E3連接酶

在PROTAC分子的應用范圍

值得注意的是，E3連接酶在PROTAC領域的開發還遠遠不夠，只有一小部分E3連接酶到了利用。有超過600個人類基因組編碼的泛素E3連接酶有待探索，雖然基于募集CRBN和VHL連接酶的PROTAC分子設計已經日漸成熟，但它們的臨床前和臨床期開發仍然面對多重挑戰。尤其在腫瘤學領域，對治療藥物的耐藥性可以迅速出現，腫瘤可能通過產生基因突變，逃避依賴非必需連接酶（比如CRBN和VHL）的蛋白降解劑作用。這些挑戰為開發新的E3連接酶提供了機會。

E3連接酶作為靶蛋白和E2泛素結合酶(E2-ub)之間的支架，通過結合兩種分子，然后催化泛素從E2的活性位點半胱氨酸轉移到靶蛋白的賴氨酸側鏈上。泛素連接酶通過多種機制實現這一催化作用。因此可以根據使用的泛素的連接策略將人類基因組中的E3連接酶分為以下幾類。

簡單概括一下：最大的一類泛素連接酶是RING連接酶，可以同時與靶蛋白和E2-Ub結合，并將泛素直接轉移到靶蛋白的賴氨酸殘基上。第二類，HECT連接酶，首先結合靶點，先將泛素轉移到自己身上，形成E3-泛素復合物，再將泛素轉移到靶點上。第三類：RBR連接酶，是RING和HECT連接策略的結合。

在早期關于激酶可降解性研究的基礎上，一項研究揭示了E3連接酶中的可降解的激酶和不同的激酶降解圖譜，突顯了連接酶選擇在靶向降解激酶方面的重要性。不同的連接酶降解活性的差異可以受幾個因素影響。一是連接酶的構象和靶點蛋白之間的互補性。二是連接酶與靶點蛋白直接構成可導致降解的三元結構的能力。形成三元復合物是PROTAC分子作用的必要步驟，但三元配合物的形成受底物影響，也就是說，三元復合物如果過于有效地形成并保持緊密結合，就不會導致有效降解。三是連接酶和靶點蛋白的細胞內定位。四是細胞特異性連接酶和靶點的表達。

因此充分利用尚未在PROTACs中使用的E3連接酶，將有利于PROTACs的發展，使其具有更多的治療優勢。

然而，可能出現的誘導腫瘤細胞產生獲得性耐藥是PROTAC分子的一個局限性。耐藥的產生是由于靶蛋白的點突變導致無法形成三元復合物而靶蛋白活性增強。對于耐藥性的出現，可以從以下三個方面考慮。(1)應用新的POI配體或新的E3連接酶。含有不同POI配體的PROTAC結合了一個新的POI口袋，可以用來減緩耐藥性，例如競爭性和變構抑制劑對BCR-ABL的抑制。(2)雙靶向治療。這種protac包含一個雙靶點彈頭或兩個彈頭分別靶向兩個靶點。(3)去泛素酶的抑制作用。去泛素酶從靶蛋白中去除泛素，在泛素-蛋白酶體系統介導的蛋白質穩態中發揮重要作用。多項研究表明，去泛素酶在耐藥性中起著重要作用。值得注意的是，去泛素酶USP15通過拮抗泛素化防止CRBN介導的底物降解。因此，鑒定和抑制介導PROTACs耐藥的去泛素酶也可能是克服癌癥耐藥和治療反應的重要方法。

綜上，PROTAC技術具有良好的治療前景，發展潛力巨大。近兩年，PROTAC標桿公司Arvinas正處于臨床關鍵階段，ARV-110和ARV-471的II/III期臨床結果會很大程度上影響PROTAC的發展策略。在未來的20年里，PROTAC技術有望在難成藥靶點和全新靶點上實現“first-in-class”的突破。