環球今亮點！火熱的PROTAC研究，已開發的E3泛素連接酶配體幾何？

在過去的十年中，靶向蛋白降解技術飛速發展，已成為一種新型的治療策略。TPD技術可以利用細胞泛素依賴的蛋白水解系統有效降解目標蛋白。盡管到目前為止已經報道了多種PROTAC，但所使用的E3連接酶配體大多局限于CRBN或VHL配體。

此外，有研究表明基于CRBN配體或VHL配體的PROTACs會產生耐藥性等問題，這些PROTACs由于E3連接酶的細胞類型特異性表達而顯示出局限性。為了克服這些障礙，各種E3連接酶配體的開發已成為人們關注的焦點，以改進當前的PROTAC技術。

什么是PROTAC？

(相關資料圖)

靶向蛋白降解(Targeted Protein Degradation, TPD)是一種新興的治療策略，被認為是克服傳統藥物開發局限性的解決方案。

TPD通過E3連接酶，進而誘導泛素蛋白酶體系統(UPS)選擇性地降解目標蛋白(POI)。

PROTAC由一個與E3連接酶配體、一個靶向POI的配體和配體之間的化學連接鏈組成（圖1）。與PROTAC一起，使用蛋白質標簽的蛋白質降解策略已經開發出來，如dTAG、AiD和SMASh Tag技術，他們同樣是通過誘導鄰近的POI泛素化降解POI。

圖1.PROTAC作用機制

圖片來源：Arvinas官網

盡管人類細胞中有超過600種E3連接酶，但只有非常有限數量的E3連接酶被用于PROTAC技術(CRBN, VHL, IAP和MDM2)。目前為止，大多數PROTACs都局限于CRBN或VHL。

然而，最近關于CRBN或VHL的PROTACs耐藥的研究強烈表明，要充分利用PROTAC策略，需要發現更多的E3連接酶配體。

此外，考慮到許多E3連接酶已被證明在特定類型的細胞或組織中過表達。例如，大腦(FBXL16, KCTD8)、胰 腺(ASB9)、骨骼肌(KLHL40, KLHL41)、睪丸(DCAF4L1)、輸卵管(DCAF8L1)。

開發新的E3連接酶可能為PROTACs提供更好的機會，可以開發出具有更高的選擇性和特異性的PROTAC，用于有效的疾病治療。

已開發的E3泛素連接酶配體

CRBN配體

在20世紀50年代，沙利度胺(1)首先由celgene開發，作為孕婦晨吐的鎮靜劑。然而，在20世紀60年代初，沙利度胺因其嚴重的致畸作用被撤出市場。

而后，沙利度胺被重新開發為一種有前途的免疫調節亞胺藥物(IMiD)，并被批準用于治療麻風結節性紅斑(ENL)和多發性骨髓瘤(圖2)。

然而，沙利度胺的作用機制一直未被闡明，直到2010年Ito等人發現沙利度胺的靶蛋白是E3泛素連接酶CRL4CRBN的一個亞基。除沙利度胺外，2011年，該團隊也鑒定了泊馬度胺（2）和來那度胺（3）的靶蛋白也為CRBN。

2018年，Crew小組報告了22種沙利度胺類似物，其中3種沙利度胺類似物(4,5,6)表現出更好的藥理特性和良好的CRBN結合親和力(4,5,6的Kd分別為555,549和111 nM)。他們發現，沙利度胺中鄰苯二酰亞胺部分的化學修飾并沒有導致CRBN結合親和力的顯著下降。

C4 Therapeutics申請了CRBN配體的合成專利，他們報道了各種哌啶2,6-二酮衍生物。熒光偏振(FP)實驗表明化合物7是最 佳的CRBN配體之一。

此外，他們發現進一步簡化得到的化合物8對CRBN同樣具有納摩爾的親和力。

Hwang小組設計了1-氨基苯并三唑-戊二酰亞胺作為新的CRBN配體，并發現了TD-106(9)，TD-106(9)為直接CRBN配體。

2019年，Kymera Therapeutics報告了各種CRBN配體，這些配體具有兩個環，與不同的連接劑綴合。其中效果最好是化合物10和SB572027 (11)。目前，其中一個配體SB572027(11)被百濟神州(Beigene)用于合成靶向BTK的PROTAC。

2021年，Rankovic小組用苯基取代了沙利度胺的鄰苯二酰亞胺基團，合成了苯酰戊二酰亞胺(PG, 12)。與沙利度胺(t1/2 = 3.3 h)相比，PG (12, IC50 = 2.191μM)表現出更為出色的穩定性。

2021年，上海藥物所王明亮團隊申請了CRBN配體的合成專利，包括化合物13和14。

2021年，諾華公司開發了基于CRBN配體15 和16的BRD9降解劑。并且，這些降解劑可以在納摩爾濃度可以有效降解BRD9 。

圖2.CRBN配體化學結構

VHL配體

VHL蛋白是Cullin 2 E3連接酶的底物受體蛋白。缺氧誘導因子1α (HIF-1α)是VHL的底物蛋白之一。

2012年，Ciulli和Crews小組首次報道了一系列針對VHL的小分子抑制劑。他們合成了一個羥基脯氨酸衍生物庫，發現了VHL/HIF-1α相互作用的抑制劑。其中，VHL配體17對VHL具有個位數的微摩爾活性。（圖3）。

在后續研究中，Ciulli團隊基于x射線晶體結構，設計優化了初始VHL配體，并于2014年報道了新的VHL配體VH03218(Kd = 185 nM)和19 (KD = 291 nM)，具有納摩爾結合親和力。

2015年，Crews團隊提出了HaloPROTAC的概念，同時設計出了VHL配體20，以此構建出的HaloPROTAC成功降解了目標蛋白 p38δ。

圖3.已報道的VHL配體

2018年，Ciulli報告了VH298 (21, KD = 52 nM)和VH101 (22, KD = 16 nM)，他們發現，增加VHL配體的親脂性導致更高的細胞通透性和更高的VHL蛋白結合親和力。

2018年，Ciulli團隊報道了具有不同立體化學特征的氟羥脯氨酸(F-Hyp) VHL配體。他們合成了4種含有VHL配體的3-氟-4 -羥基脯氨酸的非對映異構體，發現VHL可以立體選擇性地識別F-Hyp的(3R,4S)外映體(23)。

2019年，王少萌小組在前期工作的基礎上，通過在VH101上引入(S)-甲基，發現了新的VHL配體。通過SAR研究，他們發現在(S)甲基上添加酰胺基團可以增加VHL配體的親和力；基于FP的結合實驗表明，VHL-e(24)與VHL具有較高的親和力(IC50 = 190 nM)。

隨后，王少萌團隊進一步開發了弱結合VHL配體，VHL-g (25)，同樣對VHL蛋白顯示出高度的親和力。

Wang小組進一步開發了VHL配體(26)，與 ER調節劑雷洛昔芬構建了靶向ER的高效降解劑。

IAP配體

凋亡蛋白抑制劑IAPs是細胞死亡的調節因子，可控制由多種刺激引起的凋亡過程。

2007年，Vucic小組開發了一種細胞凋亡抑制劑1和2 (c-IAP1和c-IAP2)拮抗劑(MV1, 27)，它與IAP蛋白的IAP重復(BIR)結構域結合，導致 c-IAP的自泛素化和降解(KD = 5.8 nM)（圖4）。

后來，Sekine等人報道了一種不同的cIAP1配體，貝斯他丁甲酯(ME-BS, 28)。

2012年，基因泰克公司發現了cIAP1/2、ML-IAP和XIAP的一種有效拮抗劑。他們通過基于晶體結構的SAR研究開發了一種廣譜IAP抑制劑GDC-0152 (29)。

2012年，軒尼詩研究小組發現了一系列基于氨基哌啶的IAP抑制劑。他們發現，以船型固定的雙環哌啶(30 (XIAP-BIR3的KD = 0.9 μ M)是cIAP1的有效抑制劑。

2013年，Cosford小組報道了一種有效的IAP拮抗劑。其中，IAP拮抗劑(31)對IAP的結合親和力最好。

2014年，百時美施貴寶報道了異二聚IAP拮抗劑（32）對IAP具有高度親和力，并具有出色的IAP抑制活性(IC50高達3.6 nM)。

此外。輝瑞基于化合物32合成了，一種BTK PROTACBC5P (DC50 = 182 nM)。

2017年，Naito團隊開發了IAP配體LCL-161（33）及LCL-161衍生物（35、36），并開發了基于這些IAP配體的ER SNIPER, 成功降解了ER。

Astex制藥公司通過基于片段的藥物發現策略，成功發現了一種非擬肽cIAP1和XIAP抑制劑AT-IAP(34)。

AT-IAP(34)對XIAP和cIAP1表現出強烈的雙重拮抗作用(XIAP EC50 = 5.1 nM, cIAP1 EC50 = 0.32 nM)。

2020年，葛蘭素史克報告了一種基于哌柏西利的PROTAC，該PROTAC具有IAP 親和力 (37)，可用于降解CDK4和CDK6。

圖4. 已報道的IAP配體

MDM2配體

MDM2蛋白是一種E3泛素連接酶，調節p53的泛素化和降解。

2004年，羅氏公司報告了一種強效的、高選擇性的MDM2-p53相互作用的小分子抑制劑。他們通過篩選合成化合物庫確定Nutlin3(38)對MDM2具有高度親和力（圖5）。

值得注意的是，順式咪唑啉Nutlin-3(38)的兩個對映體對MDM2具有高度不同的結合親和力(對映體a = 13.6 μ M，對映體b = 0.09 μ M)。

2008年，Crews小組首次報道了基于MDM2的PROTAC，通過結合Nutlin-3(38)和一個具有PEG連接物的非甾體AR配體。

圖5.已報道的MDM2配體

2013年，Roche根據p53-MDM2配合物的晶體結構對nutin -3(38)化合物進行優化，合成了一種新的MDM2抑制劑RG7112(39)，在咪唑啉環上進行二甲基取代，用叔丁基取代甲氧基(IC50 = 18 nM)。RG7112是臨床試驗中首 個口服p53-MDM2抑制劑。

他們用吡咯烷部分取代了RG7112的咪唑啉結構，并引入了立體化學結構以獲得更高的親和力的MDM2抑制劑RG7388(40)，具有優異的療效和選擇性 (IC50 = 6 nM)。

DCAF 配體

磺胺類衍生物因其抗菌、抗真菌、抗病毒和抗癌活性而備受關注。Nijhawan的研究報道，磺胺衍生物indisulam (41)， E7820(42)和chloroquinoxaline sulfonamide (CQS, 43)作為一種分子膠，誘導E3連接酶和靶蛋白之間的蛋白-蛋白相互作用（圖6）。

2019年，Cravatt團隊使用化學蛋白質組學方法確定了DCAF16 E3連接酶作為他這些化合物（41、42、43、44）的靶蛋白。

基于類似的篩選策略，Cravatt小組也開發出E3連接酶DCAF11的親電配體(45)。利用發現的配體45，他們合成了靶向AR PROTAC，并成功降解AR。

圖6.已報道的DCAF配體

RNF配體

2019年，野村研究小組使用基于ABPP的共價配體篩選方法，報告了一組E3連接酶RNF4的配體。他們發現優化的共價配體CCW16(46)對RNF4具有高度親和力。

此外，該小組還報道了Nimbolide(47)，一種具有抗癌活性的天然產物，被鑒定為E3連接酶RNF114的共價配體。

在2021年，野村團隊同樣基于ABPP的方法發現了共價配體EN219(48)，可以靶向RNF114 (IC50 = 470 nM)（圖7）。

圖7.已報道的RNF配體

AhR配體

2019年，Naito團隊開發了一種新的PROTAC，可以招募芳基烴受體(AhR) E3連接酶復合物。他們將AhR配體(β-NF, 49)與ATRA結合，形成了一個嵌合分子β-NF-ATRA。β-NF-ATRA是一種招募CRABPs的PROTAC，通過泛素-蛋白酶體途徑以AhR依賴的方式誘導CRABPI和CRABPII降解（圖8）。

圖8. 已報道的AhR配體

FEM1B配體

CUL2 E3連接酶FEM1B最近被發現是細胞對還原應激反應的重要調節因子。2022年，野村研究小組發現了一種基于氯乙酰胺的共價配體EN106(50)(圖9)，可作為一種FEM1B配體(IC50 = 2.2μM)。

圖9.已報道的FEM1B配體

KEAP1配體

研究表明KEAP1與Nrf2相互作用可以調節細胞保護蛋白。因此，基于KEAP1-Nrf2的蛋白-蛋白相互作用抑制劑的發現在應激相關疾病的治療中引起了人們的關注。2020年，野村研究小組使用已知的KEAP1配體 (RTA 402,甲基巴多索隆(CDO- Me, 51)作為E3泛素連接酶配體，報告了一種可逆共價結合PROTAC。（圖10）。

圖10.已報道的KEAP1配體

2021年，金堅團隊報道了E3連接酶KEAP152，并開發了一種招募KEAP1的PROTAC MS83。

2022年，Lv團隊發現了一種天然產物Piperlongumine (PL, 53)，作為E3連接酶配體。他們首先用競爭性的ABPP試驗證實了PL(53)與多個E3連接酶結合。并且，他們發現當E3連接酶配體與靶蛋白配體偶聯后，E3連接酶的選擇性進一步提升。

小 結

PROTAC在過去的20年里已經發展成為治療疾病領域的新策略。為了實現有效的TPD, E3連接酶配體和靶蛋白配體的選擇是PROTAC設計的關鍵。盡管到目前為止，已經報道了多種E3泛素連接酶種類，但目前只有少數E3連接酶配體可用于TPD。

在過去的幾十年里，PROTAC的大部分研究都集中在使用CRBN或VHL配體的各種藥物靶蛋白的TPD上。然而，由于CRBN或VHL的細胞類型或組織類型依賴的表達差異化，靶蛋白降解經常受到抑制。此外，最近觀察到對CRBN或VHL的PROTACs的耐藥性。

而尚未開發的細胞或組織類型特異性E3連接酶將是一種新型PROTAC的研究基礎，它可以以空間特異性的方式控制某種蛋白質的降解。因此，新型E3連接酶配體的發現將是一個重要的研究目標，以擴大PROTACs的應用前景。期待PROTAC技術的早日成熟，為患者帶來福音！

參考文獻

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