全球快消息！多發性骨髓瘤治療靶點：CRL4 E3連接酶

多發性骨髓瘤（MM）是第二大最常見的血液系統惡性腫瘤，在臨床病征上容易復發。而免疫調節藥物（IMiDs）的引入可以說是多發性骨髓瘤治療中可顯著改善患者預后的一個重要里程碑。目前，IMiDs是新診斷和復發/難治性骨髓瘤治療的基礎。

(資料圖片僅供參考)

研究表明，IMiDs主要通過結合CRL4 E3泛素連接酶 (CRL4^CRBN) 復合物的底物受體蛋白Cereblon (CRBN) 發揮其抗骨髓瘤活性。通過結合CRBN，IMiDs改變了其底物的特性，導致骨髓瘤細胞存活所必需的蛋白質的泛素化和蛋白酶體降解。

隨著IMiDs的成功，這引發了許多學者使用CRL4^CRBN復合物的活性對治療骨髓瘤的可能性作進一步探索。在本文中，探討了骨髓瘤治療領域中的新角色，即CRBN E3連接酶調節劑（CELMODs）的研究現狀，這是新一代具有更廣泛生物活性的IMIDs。此外，我們還討論了一種新型靶向蛋白水解策略，即靶向蛋白水解嵌合體（PROTACs），利用CRL4-CRBN降解可能與骨髓瘤和其他惡性腫瘤的治療有關的不可成藥的蛋白質。

背景介紹

泛素-蛋白酶體途徑在蛋白質降解過程中起著至關重要的作用。這一過程是由參與泛素激活酶(E1)、泛素結合酶(E2)和泛素連接酶(E3)的一系列酶反應介導的，這些酶反應在整個泛素化途徑中會被ATP循環和激活，其中E3的作用是確定蛋白酶體中泛素化和隨后降解的底物特異性。

人類基因組編碼600多個E3泛素連接酶中，cullin-ring泛素連接酶（CRLs）是最大的E3連接酶家族，參與許多細胞穩態過程，如信號轉導、細胞周期調控、DNA損傷反應、轉錄調控和胚胎發育等。CRL4 E3泛素連接酶是由鋅指結構域蛋白(ROC1，也稱為RBX1)、Cullin4(Cul4)支架蛋白和DDB1-Cul4相關蛋白組成的復合物，決定了CRL4 E3活性的底物特異性。cereblon（cereblon,CRBN）是CRL4 E3底物受體之一，對免疫調節藥物等小分子的作用至關重要。通過IMiDs靶向CRBN可改變其對非生理蛋白的底物特異性，這些蛋白隨后可被相應的蛋白酶體識別和降解。（圖1A）

而這種作用機制在多發性骨髓瘤(MM)的治療中顯示出特別的相關性，所以 IMiDs的引入改變了MM患者的傳統治療藥物，且顯著改善了他們的預后。

雖然作用于CRBN的E3連接酶相關功能似乎是IMiDs 抗骨髓瘤活性的主要機制，但最近的報道表明，IMiDs也通過調節CRBN的其他特性（如伴侶功能）發揮作用。因此，為了強調更廣泛的生物活性，下一代的免疫調節劑被稱為“celmod”（Cereblon E3連接酶調節劑）。近年來，CRL4^CRBN復合物和其他E3連接酶被廣泛探索為通過異雙功能小分子降解典型的“不可成藥”蛋白的靶點，稱為蛋白水解靶向嵌合體（PROTACs）。

本文主要介紹了在多發性骨髓瘤未來的治療方法中，以CRBN依賴的方式調節CRL4^CRBNE3連接酶活性的方法。

圖1.CRL4^CRBNE3連接酶復合物泛素化研究進展

免疫調節藥物（IMiDs）

1、 IMiDs的作用機制

在2006年引入的沙利度胺是第一類的免疫調節劑，是MM治療的里程碑之一。連同其新一代的衍生物里，如來那度胺和泊馬度胺，以及蛋白酶體抑制劑和單克隆抗體，這些藥物被用于治療MM患者。沙利度胺及其類似物在闡明其作用機制之前，主要被認為是通過誘導IL-2(interleukin)和干擾素-γ等細胞因子的產生來調節T細胞、NK和NK-T細胞的功能。后來發現，沙利度胺及其類似物除了具有抗血管生成、破壞骨髓瘤細胞-骨髓基質相互作用和降低破骨細胞生成等作用外，故被稱為免疫調節藥物。隨后研究表明，CRBN的表達是IMiDs抗骨髓瘤活性所必需的，因為研究發現CRBN基因的敲除導致了骨髓瘤細胞對來那度胺和泊馬度胺產生了耐藥性。

2014年，研究人員首次闡明了免疫調節劑的關鍵作用機制。兩項研究表明，來那度胺與CRBN的相互作用改變了其底物特異性，從而誘導轉錄因子IZKF1/ 3的蛋白酶體依賴性降解。IKZF1和IKZF3被定義為CRBN的“新底物”，因為它們只有在存在IMIDs的情況下才成為CrBN的靶標。IKZF1/3的降解調控IRF4和MYC等其他基因的表達，對MM細胞的增殖和存活至關重要。而IKZF1/3-IRF4-MYC轉錄軸的破壞在MM細胞存活中起到了關鍵性作用 ，與原發性積液淋巴瘤細胞系的研究相反，其中IMiDs獨立于IKZF1和IKZF3觸發IRF4的表達下調。

最近的研究報道了多種潛在的IMIDs新底物，這些新底物需要在生理條件下驗證并轉化為IMIDs的臨床應用。在IMiDs的作用下， CRL4^CRBN E3連接酶的可以與新底物發生相互作用。在IMiDs活性下降解的新底物庫的差異可能反映了在MM治療期間觀察到的各種不良事件。沙利度胺最常見的副作用是慢性軸突神經病變，而其他以骨髓抑制為特征的藥物是最常見的毒 性。來那度胺和波馬利度胺的骨髓抑制作用是指IKZF1的降解和隨后下調轉錄因子PU.1和GATA1，前后兩者分別導致中性粒細胞減少和血小板減少。由于與沙那度胺和波馬利度胺相比，沙利度胺對IKZF的降解作用要低得多，它可能不會像它的新衍生物那樣引起這種毒 性。

此外，IMiDs還可以調節CRL4^CRBNE3連接酶的活性，以降解與特定新底物具有不同親和力的各種蛋白。底物特異性的獨特模式可能會轉化為這些藥物的臨床療效和毒 性特征的多樣性。

2.2.IMiDs的臨床療效

盡管自來那度胺引入以來，沙利度胺在MM治療中的作用一直在穩步下降，但在許多來那度胺供應不足的國家，沙利度胺、地塞米松和硼替佐米(VTD)的聯合仍是初診MM患者的關鍵方法，這些患者有資格接受大劑量化療，隨后進行自體干細胞移植（Auto-HSCT）。最近，Auto-HSCT前的VTD(沙利度胺聯合長春新堿V以及吡喃阿霉素T和地塞米松D治療方案)誘導已被證明在近95%的患者中發揮了有效反應（至少部分反應部分緩解)，證實了以前報道的結果。

如最近的第3期Cassiopeia試驗所示，通過添加Daratumumab可以進一步提高VTD在反應深度、可測量殘留疾病(MRD)陰性率和無進展生存率(PFS)方面的臨床益處，Daratumumab是一種針對CD38的一流單克隆抗體，即通常在MM細胞表面表達的抗原。

復發/難治性MM的治療是臨床實踐中的一大挑戰。對于以前沒有接觸過來那度胺的患者，單獨使用來那度胺（特別是在虛弱患者中），或與卡非佐米（Aspire試驗）Ixazomib（電氣石試驗），Daratumumab（Pollox試驗）或Elotuzumab（Eloquent-2試驗）聯合使用是高度相關的治療選擇。

反過來，對于來那度胺難治患者，除了無IMID方案（如DKD[CANDOR試驗]，DVD[Castor試驗]和KD[Endeavor試驗]外，以泊那度胺為基礎的方案也具有重要的臨床價值。根據以前的治療、表現狀況和共病情況，復發/難治性MM患者可以單獨或與抗CD38抗體（即達拉圖單抗（Apollo試驗）或伊沙妥昔單抗[ICARIA-MM試驗]、伊洛妥珠單抗（Eloquent-3試驗）、蛋白酶體抑制劑（即硼替佐米[OptimisMM試驗][65]、卡非佐米[66]和伊沙佐米以及細胞毒 性藥物（如環磷酰胺）聯合使用，但這最終還是要取決于復發/難治性MM患者。免疫調節劑隨機臨床試驗的結果總結在（表1）中。

表1. IMIDS隨機臨床試驗結果總結

CRBN E3連接酶調節劑（CELMODs）

1、Celmods的作用機制

盡管 關于免疫調節藥物（IMiDs）之間的作用機制仍未完全闡明，但已有研究發現，關于CELMODs結構的第二個擴展區域（對應于沙利度胺中的鄰苯二甲酰亞胺環）在每個 CELMoD 之間變化，并決定與 CRBN 和新的 CRL4^CRBNE3 底物的相互作用，如圖 2A、B所示。

圖2.IMIDs/CELMoDs在化學結構和IKZF1降解能力方面的差異。

區分CELMoDs與IMiDs的關鍵功能之一是CELMoDs增強了對CRBN的親和力。盡管如此，與來那度胺或波馬利多胺相比，CELMoDs的CRBN親和力大約高10-20倍。與經典IMiDs相比，觀察到CELMODs在IKZF1和IKZF3降解中更強的效力（圖2C）。

圖2.IMIDs和CELMODs的在IKZF中降解效力的比較

3.2CELMODS的臨床療效

（1）CC-92480（美齊格米特）

最近報道了臨床1/2階段CC-92480-MM-002研究的初步結果。共19例復發/難治性MM患者在前一治療中位數為3（范圍，2-4)線后接受了CC-92480（美齊多米）、硼替佐米和地塞米松的聯合治療。

（2）伊伯多胺(CC-220)

根據1/2期CC-220-MM-001研究(NCT02773030)的初步結果顯示，三聯用伊伯多胺(CC-220)在重度預處理的MM患者中顯示出良好的安全性和臨床活性。Iberdomiddaratumumab-地塞米松(IBERDD)隊列分別包括63%和58%的DaratumumaMability和四重難治（定義為對≥1個亞胺、1個PI、1個抗CD38單克隆抗體和1個類固醇的難治）患者。同樣，在伊伯多胺-硼替佐米-地塞米松（IBERVD）隊列中，難治性患者的比例很高（PI型難治性，76%；4型難治性，48%)。然而，IBERDD組和IBERVD組的客觀反應率分別為35%和50%。

重要的是，對Ibervd的反應與Daratumumab和Bortezomiberefrictory無關。值得強調的是，很大一部分患者從以伊伯多胺為基礎的治療中獲得了臨床益處，因為獲得了最小的反應或穩定的疾病。臨床獲益率和疾病控制率分別為47%和88%（IBERDD隊列）和65%和85%（IBERVD隊列）。細胞減少是聯合治療最常見的并發癥。IBERDD聯合治療復發/難治性MM計劃在第3期Excaliber-RRMM試驗(NCT04975997)中與DRD進行比較。

此外，IBERVD作為不符合HDT-Auto-HSCT條件的MM患者的一線治療方法，將在2期Borealis試驗(NCT05272826)中進行評估。在1/2期CC-220-MM-001研究(NCT02773030)中，對伊伯多胺聯合地塞米松進行了評估。107例入組患者幾乎全部為三重難治（IMID、PI和抗CD38單克隆抗體難治），25%有髓外疾病，30%有高危細胞遺傳學。依伯多胺和地塞米松治療導致26%的患者有反應。中位PFS和OS分別為3個月和11個月。

有趣的是，以前接受過抗BCMA治療的患者有類似的反應率（ORR為25%）人們對聯合療法的毒 性沒有出現新的擔憂。伊伯多米-地塞米松聯合其他抗骨髓瘤藥物如卡非佐米(NCT05199311,NCT02773030)、伊沙佐米(NCT04998786)、環磷酰胺(NCT04392037)和idecabtagene Vicleucel（Karmma-7試驗，NCT04855136)的有效性和安全性目前正在幾項早期研究中進行調查。

靶向蛋白水解嵌合體（PROTACs）

選擇性蛋白質降解技術是一種極具臨床潛力的的治療策略，這種治療方法不單單適用于MM患者。PROTAC策略是通過募集E3泛素連接酶，使其對目標靶向的蛋白質（POIs）泛素化和降解。近年來，隨著對泛素化作用機制的廣泛研究推動了PROTAC降解劑的發展。PROTAC分子由三個部位組成：

（1）一種與目標蛋白特異性結合的小分子化合物。

（2）一種與E3泛素連接酶特異性結合的化合物。

（3）一種連接靶蛋白配體和E3泛素連接酶配體的連接鏈。

PROTAC技術不需要與目標蛋白的較高結合力，因此在克服經典小分子蛋白抑制劑的潛在局限性（非共價抑制劑的瞬時靶向，蛋白質過表達或點突變引起的耐藥性）方面具有很大的優勢。這種新的策略可以有效針對“不可成藥”靶點，如關鍵的致癌蛋白。

圖3. PROTAC介導的靶向蛋白質降解的機制

目前，大多數PROTACs使用CRL4^CRBN和VHL兩種E3泛素連接酶作為招募連接酶。因此，IMIDs通常被認為是PROTAC“分子膠”部分的先驅，因為它們促進了CRBN與許多治療相關的新底物的相互作用的發現。

2015年開發了第一個基于CRBN的靶向降解BRD4的PROTAC，以沙利度胺為CRBN E3泛素連接酶配體和溴結構域作為靶向蛋白。結果表明，DBET1在MM和AML細胞系中誘導高選擇性的CRBN依賴性BET蛋白降解。基于CRL4^CRBN-聚馬立度胺相互作用的下一代PROTACs也針對BET蛋白(ARV825)，該PROTAC顯示出對MM細胞較強的抑制活性，并且在小鼠移植瘤模型中也表現出較好的抑制效果。此外，研究人員還開發了針對其他 MM 有前景的癌蛋白（如 CDK4 和 CDK6 和 MCL-1）的有效 PROTAC。

值得注意的是，使用 IMiD 或 CELMoD 治療期間不可避免出現 MM 細胞的獲得性耐藥，這可能會造成CRBN 表達改變和編碼 CRBN 的基因突變來影響基于CRL4^CRBN E3 泛素連接酶的 PROTAC 的療效。幸運的是，人類基因組編碼了 600 多種 E3 泛素連接酶。到目前為止，只有少數幾種被用于 PROTAC 的生成：VHL、MDM2、IAP（凋亡蛋白抑制劑）和 CRBN。

2022年8月，ARV-110(Adrent，NCT0388861)和ARV-471(Veritac，NCT04072952)的臨床試驗正在進行第二階段試驗。在血液學領域，具有IMiD樣活性 (NX-2127) 的首 個口服BTK降解劑的人類1期試驗目前正在招募復發/難治性B細胞惡性腫瘤患者 (nct04830137)。同樣的，另一種基于IMID的BTK降解劑(NX-5948)已進入1期試驗，用于復發/難治性B細胞惡性腫瘤的患者，包括原發性中樞神經系統淋巴瘤(NCT05131022)。最近，同樣基于IMID的STAT3降解劑(KT-333)被批準用于治療成人難治性B細胞非霍奇金淋巴瘤、T細胞淋巴瘤和實體瘤，正處于臨床I期試驗。

小結

IMIDS的引入徹底改變了多發性骨髓瘤的治療前景，并與抗癌療法聯用顯著改善了MM治療結果。沙利度胺從致畸的“黑暗藥物”到第一類IMID的發現，以及對其作用機制的廣泛研究，為我們精確和重新理解蛋白質泛素化過程提供了一個全新的視角。盡管IMIDs是MM治療中最重要的藥物之一，但針對IMIDs的適應癥也正在擴大到其他惡性腫瘤領域，如血液系統惡性腫瘤。例如，來那度胺對復發的套細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤和邊緣區淋巴瘤均有療效。期待更多的IMIDs獲批上市，為患者帶來福音。

參考文獻

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