共價小分子靶頭的設計與發展

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介紹

(相關資料圖)

具有親電性的小分子藥物可以與內源性靶蛋白的親核氨基酸殘基形成共價鍵，不可逆地改變目標蛋白的功能。由于與蛋白的結合時間增長，化合物可以持續增強藥理作用，實現異構體的選擇性抑制，克服腫瘤細胞的獲得性耐藥。

為了減小共價小分子脫靶引發毒 性的風險，共價藥物的研究集中于開發靶向共價抑制劑(TCI)，其定義為：通過合理設計，將親電性的，具有共價反應活性的靶頭引入靶蛋白的可逆配體上，使其能夠選擇性地共價結合到靶蛋白質上持續發揮抑制作用。

為了達到較高的選擇性，TCI的靶頭活性需要經過仔細調整，使其在生理條件下保持穩定，但活性又足夠讓其共價結合到靶蛋白。除了反應活性，靶頭的化學選擇性、反應方式、分子大小以及共價的可逆性也會影響TCI的最終抑制效果。

在本篇綜述中，我們將概述靶向蛋白質共價修飾這一化學手段的研究進展及其在TCI設計中的應用。盡管文中介紹的靶頭不是所有的都被應用到了體內研究，但考慮其獨特的作用機制與反應模式，其仍有很大可能在未來的臨床研究中大放異彩。

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Michael受體以及烯類和炔類親電靶頭

α,β-不飽和酰胺類Michael受體是在TCI中應用最為廣泛的靶頭。以此為靶頭靶向酪氨酸激酶如表皮生長因子受體(EGFR)和Bruton’s酪氨酸激酶(BTK)的TCI目前已有8個被FDA批準上市用以治療癌癥(圖1)。作為這些TCI藥物的靶頭，丙烯酰胺或2-丁炔酰胺通過與目標激酶ATP結合位點半胱氨酸的巰基共價結合使靶蛋白不可逆地失活。

基于活性的蛋白質譜學研究(ABPP)也進一步佐證了其共價結合模式。由于缺乏明確的，能容納小分子藥物的結合口袋，G12C突變型KRAS蛋白長期以來被認為“無藥可靶”。直到以α,β-不飽和酰胺為靶頭的TCI藥物出現才打破了這一僵局。Sotorasib (AMG-510) 現已被FDA批準用于治療 KRAS G12C突變的非小細胞肺癌。Adagrasib (MRTX-849)已與2022年被FDA批準治療KRAS G12C突變的非小細胞肺癌和胰 腺癌（圖1B）。

圖1丙烯酰胺為靶頭的共價抑制劑(A) 臨床批準的不可逆酪氨酸激酶抑制劑的化學結構(B) KRAS G12C抑制劑的化學結構

丙烯酰胺的一個顯著特征是其能夠自由調整對硫醇的反應活性，具體取決于烯烴位置的取代基。β位的氨甲基是靶向激酶TCI中的常見結構。雖然丙烯酰胺的β-甲基化會減慢其與硫醇的加成速度，但β-氨甲基丙烯酰胺則表現出與未取代的丙烯酰胺相當的硫醇反應性。

實驗和DFT研究表明，氨甲基取代基在質子化狀態下作為吸電子基團以增強α,β-不飽和酰胺的親電反應性。而Gao課題組最 先發現，在α位引入一個氟原子會顯著降低丙烯酰胺的反應性。α-氟取代的丙烯酰胺被用作KRAS G12C抑制劑阿達格拉西的靶頭，以延緩體內GST介導的谷胱甘肽(GSH)結合型藥物代謝物的產生。

與之相對的是，在α位引入吸電子氰基則會同時促進硫邁克爾加成以及逆邁克爾反應的進行。這使得半胱氨酸的巰基對雙重活化的氰基丙烯酰胺的親核加成成為了完全可逆的過程（圖2A）。

湯頓課題組就以此設計了靶向p90核糖體S6激酶RSK和BTK的可逆共價抑制劑。他們發現，TCI與目標蛋白的共價加合物除了依賴可逆的共價鍵，也會通過非共價相互作用得到穩定，而由于TCI無法與目標蛋白以外的形成有效的非共價相互作用，脫靶的硫醇加合物最終將通過反向逆邁克爾反應輕松消除。這種策略可以最大限度地降低共價藥物在體內非特異性結合引發毒 性的風險。盡管可逆共價抑制劑在靶點的停留時間可能比不可逆結合劑短，但他們發現基于氰基丙烯酰胺的BTK抑制劑的保留時間可通過改變β-側取代基的大小來調節，并在對大鼠進行的口服給藥試驗中得到證明。

Rilzabrutinib(PRN1008)已獲得快速通道指定，并且正在進行治療免疫性血小板減少癥的3期研究（圖2B）。近年來，蛋白質水解靶向嵌合體(PROTAC)等化學蛋白質降解劑已成為抑制蛋白質活性的強力策略。已有報導文獻利用基于丙烯酰胺的共價抑制劑作為PROTAC的靶蛋白結合配體。還研究了基于氰基丙烯酰胺的BTK共價可逆抑制劑在PROTAC設計中的應用（圖2C）。理論上講，可逆的共價PROTAC可以實現目標特異性的提高和目標蛋白的催化型降解。

圖2 (A) 半胱氨酸與氰基丙烯酰胺的可逆靶向結合 (B) Rilzabrutinib的化學結構。(C) 靶向BTK的可逆共價PROTAC的化學結構。藍色、紅色和綠色分別代表BTK識別配體、氰基丙烯酰胺靶頭和E3連接酶配體

丙烯酰胺型邁克爾受體通常對整個蛋白質組中的半胱氨酸殘基具有化學選擇性。除丙烯酰胺以外，其它類別的邁克爾受體也被積極運用到TCI的研究中。乙烯基砜可與硫醇發生邁克爾加成反應，通常用于病毒和寄生蟲半胱氨酸蛋白酶的不可逆抑制，也包括嚴重急性呼吸系統綜合癥冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)的主蛋白酶（圖3A）。然而，基于乙烯基砜的共價抑制劑很少在體內環境中進行測試，這可能是因為它們具有高內在反應性。最近，阿斯利康的團隊也報道了用炔基苯并惡嗪和二氫喹唑啉這兩種親電性靶頭作為丙烯酰胺的替代品。

圖3 (A) 以乙烯基砜為靶頭的SARS-CoV-2主蛋白酶不可逆共價抑制劑。(B) 具有炔基苯并惡嗪親電子試劑的共價JAK3抑制劑。親電性靶頭以紅色突出顯示。

圖4 α-氰基酮作為靶向組氨酸的共價可逆IDH1抑制劑 (A) 化合物146a和優化的衍生物 (B) 與IDH1 (PDB 6BL1)結合的146c的X衍射晶體結構。His315共價連接到烯酮前體的β位α-氰基和Se326的主鏈NH之間形成關鍵氫鍵。烯酮基與Lys374側鏈形成氫鍵，而二芳基氨基與Asp375的羧酸鹽形成電荷輔助氫鍵。

在諸多Michael親電性靶頭中也有報道能夠共價連接到靶蛋白的賴氨酸或組氨酸殘基上。組氨酸的咪唑基團也是一個非常強效的親核基團，可以用來被共價修飾。Jakob課題組首次運用α-氰基酮結構靶頭實現了對位于野生型異檸檬酸脫氫酶(IDH)1的NADPH結合口袋中His315的共價修飾。他們進一步的實驗結果表明化合物146C只會選擇性地與His315形成可逆的氮雜邁克爾加成物，而化合物中的α-氰基則會在結合口袋處形成關鍵的氫鍵引導TCI對靶蛋白的識別（圖4）。賴氨酸的胺基殘基雖然能夠被邁克爾受體所修飾。但大多數Michael受體對“較軟”的半胱氨酸硫醇更具反應性，所以靶向賴氨酸ε-氨基可能需要活性更高的親電受體。但后者有可能表現出半胱氨酸介導的脫靶效應

Michael受體是TCI設計中應用最為廣泛的親電性靶頭，主要用于靶向半胱氨酸，通過在其α位引入氰基可以加快Micheal反應的雙向進行，可用于制作可逆型共價靶頭，已經有多篇綜述報導通過在α和β位引入取代基來達到延長可逆TCI在靶點的保留時間，優化靶頭自身的反應性和化學選擇性甚至引導TCI選擇性地與其他親核性氨基酸殘基諸如組氨酸實現共價修飾。考慮到賴氨酸較弱的親核性，可以選擇磺酰胺類Michael受體為靶頭，但可能會出現對半胱氨酸的脫靶效應，所以Michael受體不作為賴氨酸修飾的首選靶頭。

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α-鹵代酰胺類親電靶頭

α-鹵代乙酰胺是另一類常見的靶向半胱氨酸親電靶頭，它通過SN2機制與硫醇反應，其反應速率取決于親核試劑和離去基團的活性。α-氯乙酰胺在生理水性條件下非常穩定但其活性又足夠共價修飾。α-鹵代酰胺的α位亞甲基由于離去基團的和羰基的吸電子作用下有更強的親電性，并且這兩個取代基也有助于其SN2-過渡態的穩定。如果+M取代基與羰基相連，那么α-鹵代甲基羰基化合物的反應性就會降低。因此，α-鹵代酯的反應性低于相應的酮，并且相應的酰胺反應性更低。

圖5 作為靶頭的鹵代烷烴 (A) SN2反應的一般機制 (B) 使得α-鹵代羰基化合物反應性增強的雙吸模型 (C) α-鹵代丙酸和乙酰胺在GSH測定中的反應性。半衰期是在pH 7.4和37 °Ca或60 °Cb下10 mM GSH時測定的。顯示N-苯基丙烯酰胺以供比較。(D) 2-氯丙酰胺 (S)-53，一種共價PDIA1抑制劑。

另一方面，α-鹵代酮的反應性會隨著鹵素離去能力的增加而增加(I > Br > Cl > F)。在這其中，α-鹵代乙酰胺用途廣泛且可用于標記各種親核試劑（通常是Cys，但也包括Lys、His、Tyr，活化的Ser和Thr等）。通過在反應位點附近引入空間位阻，進一步降低α-鹵代乙酰胺的反應性。因此α-溴丙酰胺的反應速率低于α-氯乙酰胺的反應速率（圖7C）。但在具體情況下，我們可能需要反應活性低的靶頭來提高整體化合物的選擇性。Allimuthu課題組正是利用了α-氯丙酰胺的低反應性和特異反應性，合成了(S)-CW3554（圖5D）作為蛋白質二硫化物異構酶A1 (PDIA1)的不可逆抑制劑，其在HEK293細胞中具有良好的選擇性。

總體而言，對于α-鹵代酮類這一類靶頭，最為常見的是α-鹵代酰胺，其適合用來靶向非催化位點的半胱氨酸。該類靶頭的反應活性與α位的離去基團離去能力和空間位阻相關。將α位的鹵素替換成別的離去基團，或者在α位引入大位阻的取代基都將影響靶頭的活性以及選擇性。

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羰基衍生物

4.1酯、酰胺、胺基甲酸酯以及脲

通過活化酯和酰胺對具有催化活性的氨基酸殘基進行酰基化修飾，如阿司匹林和β-內酰胺類抗生素等經典共價藥物。此類靶頭使用了各種酰化劑，包括酯、酰胺、氨基甲酸酯和脲。通常，這些靶頭優選與具有親核性的胺基（賴氨酸和蛋白質游離N-末端）或活化的羥基（絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸）反應，從而與靶向半胱氨酸的共價抑制劑有所區分。N-羥基琥珀酰亞胺基和多氟苯基酯等活化酯對賴氨酸殘基表現出廣譜反應活性。然而，這些活化酯的反應性太強反而降低了自身的化學選擇性，并且也會對體內各類水解酶敏感，加大了體內應用的難度。

圖6 N-羥基琥珀酰亞胺基和多氟苯基酯常作為共價修飾賴氨酸殘基的靶頭

圖7 以活化酯作為靶頭共價修飾PI3Kδ的Lys779

Campos團隊最近運用活性酯靶向賴氨酸側鏈的能力，合成一種有強效的靶向PI3Kδ的共價抑制劑，由于臨床候選藥GSK229276 115已被證實是依賴磺胺部分來與保守的Lys779 ε-氨基相互作用，他們就將原磺胺結構替換成了活性更強的活化酯 (116a-f)，并且最終優化出了對氟苯酚甲酸酯這一新靶頭，與之對應的化合物117展現出對PI3Kδ更強的抑制作用以及更好的化學選擇性（圖7）。而活化的胺基甲酸脂則被用于修飾有催化活性的絲氨酸。

4.2醛、酮和乙腈

醛和酮對親核性氨基酸殘基表現出廣譜的反應活性。醛和酮聚合的肽類似物通過與羥基和巰基形成半縮醛復合物來達到可逆的共價效果。例如，α-酮酰胺化合物telaprevir和boceprevir與丙型肝炎病毒NS3/4A的具有催化活性的絲氨酸殘基發生反應。腈也可用作靶向蛋白酶的可逆共價靶頭。維格列汀和沙格列汀是二肽基肽酶4 (DPP-4)抑制劑，用于治療2型糖尿病。它們的腈部分與DPP-4的催化活性絲氨酸殘基形成可逆的共價鍵。

2019年新型冠狀病毒(COVID19) 的全球大流行促使針對其致病病原體SARS-CoV-2的抗病毒 藥物的開發。上述提及的醛、酮和乙腈這幾個可逆靶頭已被用于開發靶向SARS-CoV-2 Mpro的共價抑制劑，其中一些已被證明在體內有效（圖8A）。醛酮類靶頭也可以與分子中的硼酸基團聯合，穩定抑制劑與靶蛋白的結合（圖8B）。與芳香醛或酮相鄰的硼酸不僅加速亞胺與賴氨酸氨基的形成，而且穩定形成的亞胺加合物。Su課題組利用這種化學方法開發了靶向髓細胞白血病1 (Mcl-1)的可逆共價抑制劑。

圖8 (A) SARS-CoV-2 Mpro的可逆共價抑制劑 (B) 對賴氨酸殘基實現可逆共價修飾的亞氨基硼酸鹽。親電靶頭以紅色突出顯示

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氟化磺酰類靶頭

氟磺酰是共價修飾賴氨酸ε-氨基的最適合的靶頭之一，其還被用于靶向酪氨酸、活化的絲氨酸或蘇氨酸殘基，并且對半胱氨酸和組氨酸側鏈也具有反應活性。在這類結構中，氟磺酰亞胺擁有出色的穩定性、多功能性和可調節性，是很好的酪氨酸和賴氨酸靶頭。芳基氟硫酸鹽在pH=7.5時非常穩定，既不會發生水解也不會被N-α-乙酰基賴氨酸或酪氨酸取代，由于其反應性較低一般作為潛在的親電靶頭，只有在特定條件下，比如結合到特定蛋白位點后，結合口袋區的氨基酸殘基能夠提供氫鍵供體或者親電基團來穩定可離去的氟離子，這時候芳基氟硫酸鹽的活性才能被喚醒。

Taunton課題組最近報道了靶向真核翻譯起始因子4E (eIF4E)和Hsp90的賴氨酸共價抑制劑（圖9A）。Pellecchia課題組報導了X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)的共價配體和靶向Mcl-1的共價肽。這些基于芳基氟磺酰的藥物可以通過靶向蛋白質表面的賴氨酸來抑制PPI。Pellecchia課題組報導了一種基于芳基氟硫酸鹽的共價XIAP抑制劑，其靶向BIR3結構域的Lys311（圖9B）。他們的芳基氟硫酸鹽作為潛在的親電子靶頭，僅在蛋白質靶標的結合口袋中產生反應活性。

Kelly和Sharpless小組以亞硫酰四氟化物氣體模塊化合成亞硫酰亞胺基氟化物SAF（圖9C）。其合成的SAF 21靶向到NAD+結合位點的Tyr907并不可逆地抑制其在活細胞中的活性。Hsu團隊將苯基氟磺酰的離去基團由原本的氟更改為三唑，用于靶向活細胞中的酪氨酸和賴氨酸殘基。有趣的是，對三唑離去基團的化學修飾提高了靶頭對酪氨酸的化學選擇性。與氟磺酰對應體相比，苯基磺酰三唑與蛋白質的反應性顯著提高。他們合成的HHS-0701 (23)被鑒定為前列腺素還原酶2 (PTGR2)的共價抑制劑。

圖9用于蛋白質共價修飾的硫(VI)氟類化合物 (A) 基于芳基氟磺酰的共價抑制劑靶向賴氨酸殘基 (B) 具有芳基氟硫酸鹽親電靶頭的XIAP抑制劑 (C) 從亞硫酰四氟化物氣體模塊化合成亞硫酰亞胺基氟化物和基于SAF的PARP1抑制劑21的結構 (D) 酪氨酸選擇性的SuTEx探針22和細胞內活性PTGR2抑制劑23的結構。親電靶頭以紅色突出顯示

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其他類型靶頭

6.1芳鹵和芳基磺酮

親核芳香取代(SNAr)反應在蛋白質靶向共價修飾領域有著悠久的歷史。通過改變芳環取代基和離去基團的電性，我們可以輕松地調整SNAr親電子試劑的反應性。4-氯硝基苯在蛋白質組學中表現出對半胱氨酸的化學選擇性，而二氯三嗪對賴氨酸具有高度選擇性。以此類結構為靶頭的藥物，例如2-氯喹喔啉L-764406（25，圖10B），2-氯苯甲酰胺GW9662 (26)和2-磺酰基吡啶GSK3787(27)被用于靶向過氧化物酶增值因子激活受體(PPAR)的非催化活性半胱氨酸。2-磺酰惡二唑，如28所示，通過與催化絲氨酸共價結合以阻斷AmpC β-內酰胺酶，或作為馬來酰亞胺替代物用于促進血清穩定抗體偶聯物的產生。

圖10基于SNAR原理的共價抑制劑（A）半胱氨酸殘基與鹵代芳烴發生SNAR反應機理（B）早期以SNAR為基礎設計的共價配體。離去基團已用紅色標出

表1 應變分子，硼酸類共價靶頭

6.2應變分子的親電試劑

應變分子的獨特反應性已在共價藥物研究中成功得到利用。環氧化物存在于各種具有生物活性的天然產物和共價抑制劑中（表1）例如，Fumagillin通過與活性位點His231的共價結合不可逆地抑制甲硫氨酸肽酶2 (MetAP2)。Carfilzomib是四肽環氧酮天然產物epoxomicin的類似物。它與20S蛋白酶體的催化活性蘇氨酸殘基不可逆地共價結合，被批準用于臨床治療多發性骨髓瘤。環氧化物的氧原子質子化對于靶頭親電性的激活非常重要。雙環[1.1.0]丁烷(BCB)是一種高度應變的碳環，具有獨特的蝴蝶形結構。（表1）雖然BCB環系統通常是熱穩定的，但在橋頭碳上引入吸電子基團(EWG)將促進應變驅動的親核加成。Baran團隊證實了BCB砜可選擇性地與半胱氨酸硫醇結合。

6.3硼酸以及硼酸酯

硼酸和硼酸酯的硼中心與絲氨酸和蘇氨酸殘基的羥基形成可逆的共價鍵。（表2）硼替佐米和伊沙佐米已被臨床批準用于治療多發性骨髓瘤。這些藥物通過靶頭的硼中心與催化活性的蘇氨酸殘基結合來抑制20S蛋白酶體。

6.4乙二醛類

Dovegan團隊以4-疊氮苯基乙二醛(APG)作為親電性彈頭，成功實現了對天然抗體中的精氨酸殘基的選擇性共價修飾（圖11A）。APG和精氨酸的胍基之間的選擇性反應讓該團隊輕松在單克隆抗體曲妥珠單抗上引入了疊氮基。Zhang小組使用α,β-二酮酰胺作為靶向精氨酸的靶頭，首次實現了對K-Ras(G12R)突變體的選擇性修飾（圖11B）。因此通過合理設計乙二醛的類似物，或許能實現目標蛋白賴氨酸殘基的選擇性修飾。

圖11 （A）4-疊氮苯基乙二醛對抗體賴氨酸殘基的選擇性修飾（B）K-Ras(G12R)·GDP·4加合物的共晶結構 (C)化合物4共價修飾Arg12殘基

6.5 其他用于TCI設計和化學選擇性生物聚合的化學策略

目前共價藥物的研究通常利用蛋白質氨基酸殘基的親核反應性設計靶頭，例如半胱氨酸、賴氨酸和活化的絲氨酸/蘇氨酸。然而，對其他氨基酸側鏈的化學選擇性共價修飾是擴大蛋白質共價配體庫的重要方向。圖12總結了蛋白質氨基酸殘基化學選擇性生物偶聯的最新進展。

圖12 針對研究較少的氨基酸殘基實現化學選擇性共價修飾的靶頭

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結論

本篇綜述簡單介紹了用于選擇性修飾目標蛋白的共價靶頭，歸納了其結構特征及其類別。從藥物研發的角度，TCI靶頭應在體內生物條件下保持化學和代謝的穩定，同時保持對目標蛋白質的足夠反應性。雖然目前大多數批準的TCIs使用Michael受體型靶頭，但隨著新的親電靶頭結構被不斷報導，我們相信后者在未來將展現出獨特的臨床價值。

可逆共價抑制劑作為另一種寶貴的治療策略，在實現精確靶向的同時，也減輕了脫靶反應引起的副作用。本文中提到的所有靶頭皆為親電性靶頭，其自身結構和鄰位取代基的電性，所靶向氨基酸殘基的親核性都會影響靶頭的反應活性和化學選擇性。而想要提高TCI對目標蛋白的靶向性，則需要增加靶蛋白結合口袋位置與TCI分子之間的非共價相互作用。

除此以外，積極地對靶頭的取代基進行構效研究也有助于增強靶頭的共價反應活性，甚至得到可逆的共價抑制劑。除了親核性較強的氨基酸，其他與癌癥、疾病和生理功能密切相關的氨基酸諸如精氨酸和甲硫氨酸也是共價靶頭的研究重點，對后者的探索將擴大共價靶頭的化合物庫，豐富TCI的靶點種類并促進以TCI為基礎的化學療法例如化學蛋白降解劑、PPI抑制劑和抗體-藥物偶聯物的開發。